Родился в с. Пузачи Тимского уезда Курской губернии в семье священника.
В 14-летнем возрасте провёл первое исследование на осах-колетах и написал научную работу об их топографических способностях. Описание этого опыта опубликовано спустя 10 лет (в 1908) в журнале «Естествознание и география».
В 1905 г., окончил Курскую духовную семинарию, С. Малышев становится студентом Петербургского университета.
После окончания учёбы остаётся при кафедре зоологии В.М. Шимкевича для подготовки к профессорскому званию.
В 1913 г. Малышев получил степень магистра зоологии и сравнительной анатомии, а через год успешно защитил диссертацию на тему «Жизнь и инстинкты цератины » в Юрьевском (ныне Тартусском) университете, избран приват-доцентом и в 1915-1916 гг. читал курс лекций.
Заинтересовавшись изучением поведения насекомых — зооэтикой и зоопсихологией, считавшимися малоперспективным направлением в биологии, С.И. Малышев с 1918 г. стал заведовать зоопсихологическим отделом в Научном институте им. П.Ф. Лесгафта.
В самый разгар гражданской войны в России его направили в слободу Борисовка Курской губернии для организации зоопсихологической станции.
В феврале 1920 г. С.И. Малышев подготовил письмо в правительство о необходимости взятия под охрану уникального лесного массива в окрестностях Борисовки.
В ответ на это письмо принято решение о создании заповедника «Лес-на-Ворскле» (ныне заповедник «Белогорье»).
Одновременно с научной работой С.И. Малышев читал курс лекций «Полезные насекомые» в Ленинградском университете, где его избрали профессором.
Исследованиями Малышева интересовался физиолог И. П. Павлов. В его институте физиологии (в п. Колтуши Ленинградской области) Малышев в течение 12 лет заведовал лабораторией биологии насекомых. Затем вернулся в институт им. П.Ф. Лесгафта, работал в институте эволюционной физиологии им. И.М. Сеченова.
Основной же его «лабораторией» в течение 30 лет был Хоперский заповедник в Воронежской области, который он организовал в 1936 г. и куда ежегодно выезжал для наблюдений.
В последние годы жизни С.И. Малышев работал в Колтушах в институте им. И.П. Павлова.
Кроме теоретических исследований, С.И. Малышев занимался практическими вопросами пчеловодства и защиты растений.
В 1923 г. на Всероссийской выставке в Москве обнародовал метод искусственного получения пчелиных маток.
Разработанные С.И. Малышевым, метод выкачивания мёда из ульев без помощи центрифуги и способ поселения пчёл на открытом воздухе без ульев, широко использовались в народном хозяйстве. Труды Малышев по пчеловодству опубликованы в Германии (1933) и в Англии (1968).
С.И. Малышев вошёл в число выдающихся энтомологов мира наряду с Р.А. Реомюром и Ж.А. Фабром.
Скончался и похоронен в Ленинграде.
Соч.:
К биологии ординеров и их паразитов. СПб., 1911.;
Жизнь и инстинкты цератин. СПб., 1913.
Наставление к собиранию и изучению гнёзд пчёл и некоторых других перепончатокрылых. Л., 1931;
И.В. Мичурин — великий русский учёный, преобразователь природы. Кишинев, 1955.
Перепончатокрылые, их происхождение и эволюция. М., Сов. наука. 1959.
Дикие опылители на службе у человека. М.-Л., 1963.
Становление перепончатокрылых и фазы их эволюции. М.-Л., 1966.
Ист.: Шахов Н. Сергей Иванович Малышев (1884 – 1967)//Сеймские берега. 1996. № 1-2.